Descubrimiento de moléculas pequeñas que inhiben la proteína desordenada, p27Kip1

Scientific Reports volumen 5, Número de artículo: 15686 (2015) Citar este artículo

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Las proteínas desordenadas son muy frecuentes en los sistemas biológicos, controlan innumerables procesos reguladores y de señalización y sus niveles y/o localización celular a menudo se alteran en enfermedades humanas. A diferencia de las proteínas plegadas, las proteínas desordenadas, debido a la heterogeneidad conformacional y la dinámica, no se consideran dianas farmacológicas viables. Desafiamos este paradigma mediante la identificación a través de la detección basada en RMN de pequeñas moléculas que se unen específicamente, aunque débilmente, al regulador del ciclo celular desordenado, p27Kip1 (p27). Dos grupos de moléculas unidas a sitios creados por grupos transitorios de residuos aromáticos dentro de p27. Las características químicas conservadas dentro de estos dos grupos de moléculas pequeñas exhibieron complementariedad con sus sitios de unión dentro de p27, estableciendo relaciones estructura-actividad para moléculas pequeñas: interacciones de proteínas desordenadas. Finalmente, un compuesto contrarrestó la función inhibidora de Cdk2/ciclina A de p27 in vitro, proporcionando una prueba de principio de que las moléculas pequeñas pueden inhibir la función de una proteína desordenada (p27) a través del secuestro en una conformación incapaz de plegarse y unirse a una proteína natural. objetivo regulatorio (Cdk2/ciclina A).

Las proteínas intrínsecamente desordenadas (IDP) son muy frecuentes en las células eucariotas y, a menudo, realizan funciones reguladoras y de señalización1. Como clase estructural, las IDP están más estrictamente reguladas que las proteínas plegadas de la levadura a los humanos2 y, al sobreexpresarse, son más propensas a alterar el fenotipo celular que sus contrapartes plegadas3. Por lo tanto, mantener la homeostasis normal de proteínas desordenadas es fundamental para el comportamiento celular. Los fenotipos asociados con la sobreexpresión o la hiperactividad de proteínas con dominios plegados pueden contrarrestarse con inhibidores de moléculas pequeñas de, por ejemplo, la función enzimática (p. ej., Gleevec, que inhibe BCR-Abl en la leucemia mielógena crónica4) o interacciones proteína-proteína (p. ej., ABT- 263 y ABT-199 que inhiben BCL-2 y BCL-xL en neoplasias malignas hematológicas y linfoides5,6). Por el contrario, las proteínas desordenadas representan objetivos desafiantes para la inhibición de moléculas pequeñas debido a sus conformaciones dinámicas y heterogéneas. No obstante, se ha avanzado. Por ejemplo, recientemente se demostró mediante ensayos estructurales, bioquímicos y funcionales que un inhibidor de la fosfatasa PTP1B (MSI-1436), con funciones conocidas en la diabetes, la obesidad y el cáncer de mama, actúa a través de un mecanismo alostérico al unirse a una región reguladora desordenada de la enzima7. Además, una molécula pequeña (YK-4-279) que se une a la oncoproteína de fusión desordenada EWS-FLI1 asociada con los tumores de la familia del sarcoma de Ewing inhibió la unión directa a la ARN helicasa A (RHA)8, un socio funcional de EWS-FLI1 en las células tumorales8 y alteración de las interacciones proteicas dependientes de RHA y empalme de ARN9. Ambos compuestos (MSI-1436 y YK-4-279) exhibieron efectos en el objetivo en ensayos celulares8,9. Otros estudios han identificado moléculas pequeñas que se dirigen a cMyc10,11,12, α-sinucleína13 y péptido β-amiloide de Alzheimer14. Un estudio computacional reciente15 mostró que una molécula pequeña (10074-A4) previamente reportada para modular la función cMyc10 se unía de diferentes maneras a diferentes moléculas cMyc dentro de un conjunto de muchas conformaciones desordenadas, lo que llevó a los autores a sugerir el concepto de "nubes de ligandos que se unen a proteínas nubes". En los estudios discutidos anteriormente, se descubrieron moléculas pequeñas que se dirigen a proteínas desordenadas utilizando una variedad de enfoques, que incluyen pantallas funcionales, pantallas de unión in vitro y/o pantallas computacionales. La detección basada en resonancia magnética nuclear (RMN) de moléculas pequeñas de bajo peso molecular denominadas fragmentos (revisado en 16) que se unen a proteínas plegadas es un método bien establecido para identificar "éxitos" iniciales en el proceso de descubrimiento de fármacos17,18. Sin embargo, hasta donde sabemos, la detección de fragmentos basada en RMN no se ha aplicado para identificar moléculas pequeñas que se unen a una proteína diana desordenada. Aquí, utilizamos la detección basada en RMN para identificar fragmentos de moléculas que se unen y modulan la función de la proteína desordenada prototípica, p27Kip1 (p27; también conocida como CDKN1B), un regulador de las quinasas dependientes de ciclina que controlan la división de células eucariotas19.

La motivación para apuntar a p27 fue doble. En primer lugar, las características estructurales y funcionales de p27 se conocen bien20,21,22,23, lo que proporciona un sistema modelo ideal para estudiar las interacciones entre moléculas pequeñas y proteínas desordenadas. En segundo lugar, la capacidad de modular químicamente la función de p27 sería beneficiosa en varios entornos biológicos. Por ejemplo, p27 se fosforila de manera inapropiada en el cáncer de mama en la treonina 157, que se asocia con una localización citoplasmática anormal y una regulación ascendente de la migración celular24,25,26,27. La disponibilidad de una molécula pequeña inhibidora de p27 sería beneficiosa para prevenir la migración anormal de células de cáncer de mama. Alternativamente, tanto en las células epiteliales sensoriales como en las no sensoriales del oído interno, p27 mantiene la salida del ciclo celular y la diferenciación terminal28 y su inhibición resultó en su reingreso al ciclo celular y regeneración para la restauración de la audición29,30. Si bien se han informado moléculas pequeñas que inhiben la transcripción de p2731, aquí desarrollamos enfoques para identificar moléculas pequeñas que se unen directamente a p27 y tienen potencial para alterar su función en los dos entornos celulares discutidos anteriormente.

El objetivo de nuestros estudios fue el dominio inhibidor de cinasa N-terminal de p27 (p27-KID), que se une y regula la actividad catalítica de los complejos de cinasa dependiente de ciclina nuclear (Cdk)/ciclina que controlan la división de células eucariotas32. p27-KID, que está muy desordenado de forma aislada20,21, adopta una conformación extendida al unirse a Cdk2/ciclina A (Fig. 1a) que se puede subdividir en tres subdominios funcionalmente distintos. El subdominio D1 se une a un bolsillo conservado en la ciclina A y bloquea el reclutamiento de sustrato33; el subdominio D2 forma cadenas β intra e intermoleculares (entre p27 y Cdk2) al unirse a Cdk2 y también inserta una vuelta de hélice en su bolsillo de unión de ATP, inhibiendo la actividad de la quinasa34; y el subdominio LH forma una hélice α que conecta los subdominios D1 y D2. Presumimos que, si se pudieran identificar moléculas pequeñas que se unen a p27-KID, podrían inducir al polipéptido desordenado a adoptar conformaciones que son incompetentes para unirse a complejos Cdk/ciclina. Probamos esta hipótesis examinando una biblioteca de moléculas de fragmentos para unirse a p27-KID usando espectroscopia de RMN. Identificamos dos subconjuntos de moléculas de fragmentos (36 en total) que se unen de manera diferencial de manera débil pero específica a dos regiones parcialmente superpuestas de p27-KID. A partir de estos subconjuntos, luego generamos modelos de farmacóforos que permitieron la identificación de moléculas pequeñas adicionales que se unían a p27-KID y una mayor aclaración de las relaciones estructura-actividad. Se utilizaron una variedad de ensayos, que incluyen anisotropía de fluorescencia, espectroscopia de RMN y un ensayo de actividad de quinasa Cdk2, para demostrar que una de las moléculas pequeñas identificadas desplazó la región de unión a quinasa de p27 de Cdk2 y restauró parcialmente la actividad catalítica de Cdk2. Además, los cálculos de dinámica molecular proporcionaron información sobre la "estructura" dinámica de la región de p27 a la que se dirigen las moléculas pequeñas. Nuestros resultados proporcionan información sobre la naturaleza de las interacciones entre las moléculas pequeñas y una proteína desordenada y demuestran que tales interacciones pueden alterar la función reguladora de la proteína desordenada.

Identificación de dos grupos de moléculas pequeñas que se unen específicamente a regiones distintas pero superpuestas de p27-KID desordenado.

(a) Estructura de p27-KID unida a Cdk2/Ciclina A (PDB ID 1JSU); se indican los subdominios de p27-KID, incluidos D1, LH, D2.1, D2.2 y D2.3. ( b, c ) Estructuras químicas de dos moléculas pequeñas, SJ572710 (SJ710) ( b ) y SJ572403 (SJ403) ( c ), que se unieron a p27-KID y son miembros del Grupo 1 y Grupo 2, respectivamente (ver texto para Grupo definiciones). ( d, e ) Histogramas que muestran valores de perturbación de desplazamiento químico 1H individuales (a través del análisis de espectros HSQC "en fase" 2D 1H-15N) de valoraciones de los compuestos en (b) y (c), respectivamente, en 15N-p27- NIÑO. El umbral para identificar interacciones específicas con residuos de p27-KID se definió como dos desviaciones estándar por encima del promedio de los valores de perturbación (representados por una línea negra punteada en el gráfico). La resolución espectral experimental en la dimensión 1H (2,4 Hz) está representada por la línea punteada magenta. Se muestran las perturbaciones de desplazamiento químico para relaciones molares de 15N-p27-KID (100 μM) a inhibidores de 1:30. ( f, g ) Perturbaciones de desplazamiento químico de protones de amida representadas frente a la concentración de SJ710 ( f ) y SJ403 ( g ), respectivamente. Las isotermas de unión de residuos seleccionados muestran unión específica entre p27-KID y fragmentos acertados. Las trayectorias de los cambios químicos (líneas negras continuas) informan constantes de disociación global de 4,8 ± 1,3 y 2,2 ± 0,3 mM para las interacciones de p27-KID con SJ710 (f) y SJ403 (g), respectivamente.

Utilizamos métodos unidimensionales (1D) 1H WaterLOGSY35 y STD36 NMR para identificar moléculas pequeñas "similares a fragmentos"37,38,39 que se unían a p27-KID. Los fragmentos de moléculas se seleccionaron de una biblioteca comercial (1100 compuestos de la colección Ro3, Maybridge/Thermo Fisher Scientific) o de una biblioteca interna de 1222 compuestos basada en la "Regla de los tres"40 y otros criterios (ver Métodos). Se identificaron dos y siete moléculas cada una de las bibliotecas respectivas para unirse a p27-KID (denominados "éxitos"; los datos representativos de RMN 1D 1H se muestran en la Fig. 1a, b del suplemento y todos los éxitos preliminares se presentan en la Tabla 1a del suplemento). Los sitios de unión para estos compuestos se identificaron mediante titulación en 15N-p27-KID y análisis de espectros bidimensionales (2D) 1H-15N HSQC. Las perturbaciones de cambio químico (CSP) significativas, que fueron más grandes para las resonancias de amida 1H (ver Métodos), solo se observaron para grupos de residuos de amida dentro del subdominio D2 de p27-KID (p27-D2); ocho aciertos causaron CSP dentro de una región corta con la secuencia F87YY89 [(F, fenilalanina e Y, tirosina), denominada subregión D2.3; Fig. 1a,d] y un golpe causó CSP dentro de la misma región, así como dentro de otras dos regiones cerca de los residuos W60N61 y E75WQ77 [(W, triptófano; N, asparagina; E, ácido glutámico; y Q, glutamina), denominados sub -dominios D2.1 y D2.2, respectivamente; Figura 1a,e]. Llamamos a estas moléculas Grupos 1 y 2, respectivamente (Fig. 1b, c); los histogramas representativos de 1H CSP se muestran en la Fig. 1d, e y los 15N CSP se presentan en Suppl. Fig. 2. Los datos de todas las demás moléculas pequeñas se muestran en el suplemento. Fig. 3.

Analizamos las moléculas de los grupos 1 y 2 mediante modelado computacional e identificamos moléculas de unión a p27-KID candidatas adicionales en las dos bibliotecas de fragmentos que no fueron detectadas por las pantallas originales de RMN 1D. El análisis de RMN 1D y 2D de estas moléculas condujo a la identificación de 15 compuestos adicionales de unión a p27-D2 (seis con características de unión similares al Grupo 1 y nueve con características similares al Grupo 2; Supl. Fig. 3b y Supl. Tabla 1b) . Se observaron CSP en altas concentraciones de compuestos, consistentes con una unión relativamente débil a p27-D2, pero fueron específicos para las regiones mencionadas dentro de p27-D2 y rigurosamente reproducibles. Titulaciones de RMN HSQC "en fase" 2D 1H-15N de dieciséis puntos de un Grupo 1 (SJ572710, en lo sucesivo denominado SJ710) y 2 (SJ572403, en lo sucesivo denominado SJ403) alcanza, respectivamente, una concentración constante de 15N-p27-KID (100 μM), proporcionó isotermas de unión interpretables para resonancias específicas de p27-KID; los valores de la constante de disociación determinada (Kd) fueron 4, 8 ± 1, 3 y 2, 2 ± 0, 3 mM, respectivamente (Fig. 1f, g). Los espectros 2D 1H-15N HSQC NMR superpuestos se muestran en la Fig. 2.

Los aciertos de fragmentos muestran interacciones específicas con regiones específicas dentro del subdominio D2 de p27-KID.

Superposición de espectros de RMN HSQC 2D 1H-15N "en fase" que muestran perturbaciones de desplazamiento químico de residuos específicos dentro del subdominio D2 de p27-KID después de que la titulación del fragmento alcance SJ710 (a, Grupo 1) y SJ403 (d, Grupo 2). Para cada golpe, se registraron un total de dieciséis espectros. La concentración de 15N-p27-KID (100 μM) se mantuvo constante durante la titulación y la concentración del inhibidor se varió de 0 (rojo) a 3 mM (azul). Todos los experimentos se realizaron en un espectrómetro de 800 MHz y utilizaron parámetros de adquisición que proporcionaron una resolución espectral de 2,4 Hz y 1,7 Hz en las dimensiones 1H y 15N, respectivamente. Las inserciones en la parte inferior izquierda muestran resonancias para los restos NH de triptófano indol (s-W60, s-W76). ( b, e ) Regiones expandidas (recuadro azul) que muestran un subconjunto de los residuos de p27-KID involucrados en la interacción con SJ710 ( b ) y SJ403 ( e ), respectivamente. ( c, f ) Regiones expandidas (recuadro negro) que muestran dos de los residuos de p27-KID que no muestran perturbaciones al interactuar con SJ710 (c) y SJ403 (f), respectivamente.

El análisis de campo de interacción molecular tridimensional (3D)41 (consulte la sección Métodos) identificó características químicas comunes de los dos grupos de moléculas de unión a p27-D2 (Fig. 3a,b). Este análisis reveló "puntos de campo" de interacción alrededor de las moléculas pequeñas que pueden participar favorablemente en interacciones electrostáticas, de van der Waals e hidrofóbicas. Estos puntos de campo se utilizan para calcular la similitud molecular y para alinear moléculas, incluso aquellas con diferentes topologías bidimensionales, para definir un farmacóforo común.

Mapas de campo de consenso para los dos grupos de moléculas pequeñas que se unieron a p27-KID.

Los puntos de campo azul y rojo indican dónde se favorecen los grupos electropositivos y electronegativos, respectivamente, en el compañero de unión a proteínas; los puntos de campo de oro indican regiones donde se favorecen las interacciones hidrofóbicas; y los puntos de campo amarillos indican regiones donde son posibles los contactos favorables de van der Waals. El tamaño del punto de campo aumenta con la magnitud de la energía de interacción favorable. Dos moléculas representativas del Grupo 1 (a) y el Grupo 2 (b) se muestran alineadas con sus respectivos mapas de campo de consenso.

Las moléculas de los Grupos 1 y 2 tienen dos o tres anillos aromáticos heterocíclicos pero difieren significativamente en la distribución de puntos de campo favorables. El grupo 1 se define principalmente por un gran núcleo hidrofóbico (múltiples polígonos dorados muy cerca; Fig. 3a), una gran región de interacción electropositiva (dos polígonos cian muy cerca) y dos puntos de campo electropositivo (cian) y electronegativo (rojo) más pequeños en el extremo opuesto del núcleo hidrofóbico. En contraste, el mapa de campo para el Grupo 2 (Fig. 3b) exhibió un núcleo hidrofóbico más pequeño en relación con el Grupo 1 y dos regiones de igual tamaño de interacción electropositiva favorable. Para expandir la diversidad de nuestra pantalla química, usamos los mapas de campo de consenso para las moléculas del Grupo 1 y 2 para identificar 184 moléculas de unión a p27-D2 posibles adicionales dentro de una biblioteca de 10,455 moléculas similares a fragmentos disponibles comercialmente. El análisis de RMN 1D y 2D de estos identificó 12 compuestos de unión a p27-D2 adicionales (8 con características de unión similares al Grupo 1 y 4 con características similares al Grupo 2; Supl. Fig. 3c y Supl. Tabla 1c). Estas moléculas adicionales tenían perfiles de CSP comparables a los hits previamente identificados. Para probar aún más la especificidad de las interacciones de molécula pequeña: proteína desordenada, determinamos si los aminoácidos simples triptófano y tirosina se unían a p27-KID. Sin embargo, incluso cuando se titula a un exceso molar de 30 veces, ninguno de los aminoácidos aromáticos causa perturbaciones de desplazamiento químico en los espectros de HSQC 2D tras la titulación en p27-KID (suplemento Fig. 4). Lo más probable es que esto se deba a que carecen de las características químicas específicas incorporadas en los modelos de farmacóforos para los dos grupos de impactos de fragmentos.

Usamos la molécula del Grupo 2, SJ403 (Tabla complementaria 1b), para probar nuestra hipótesis de que las moléculas que se unen a p27 pueden alterar su función reguladora de Cdk. Para estos experimentos, debido a que SJ403 se une débilmente a p27-KID, estudiamos su capacidad para modular la unión de p27-D2 a Cdk2/ciclina A (valor de Kd que se une a Cdk2/ciclina A, 73 ± 8 nM; Fig. 4a versus 5 nM para p27-KID20). Primero usamos anisotropía de fluorescencia (FA) para monitorear el desplazamiento de un mutante de cisteína única (Cys) de p27-D2, con arginina 93 mutada a Cys (R93C) y marcada con Alexa Fluor 488 (p27-D2-FL), de Cdk2 /ciclina A por SJ403. La titulación de SJ403 provocó una reducción dependiente de la concentración de FA de p27-D2-FL, con un valor de IC50 de 475 ± 67 μM (Fig. 4b), lo que sugiere que SJ403 desplazó a p27-D2 de Cdk2/ciclina A.

Análisis de anisotropía de fluorescencia del desplazamiento de p27-D2-FL de Cdk2/ciclina A por SJ403.

( a ) Análisis de anisotropía de fluorescencia de la unión de Cdk2 / ciclina A a p27-D2-FL. La condición inicial (p27-D2-FL 20 nM, Cdk2/ciclina A 300 nM) para evaluar el efecto del impacto del fragmento SJ403 en la función de p27 se representa como el círculo rojo en la isoterma de unión. ( b ) La titulación de SJ403 (0–3 mM) provocó el desplazamiento de p27-D2 de Cdk2 / ciclina A, lo que resultó en una disminución en los valores de anisotropía de fluorescencia. Los experimentos se realizaron por triplicado y los valores medios y se muestran las desviaciones estándar de las medias.

A continuación, utilizamos la espectroscopia de RMN para controlar el desplazamiento de p27-D2 marcado con 2H/13C/15N de Cdk2/ciclina A por SJ403; el complejo de p27-D2 con Cdk2/ciclina A (100 μM) se preparó con un ligero exceso de 2H/13C/15N-p27-D2 (relación molar, 1,1:1,0 p27-D2:Cdk2/ciclina A). Los picos de p27-D2 no unido aumentaron drásticamente en intensidad en presencia de SJ403, mientras que las resonancias de p27-D2 unido a Cdk2/ciclina A se redujeron en intensidad (Fig. 5 y Supl. Fig. 7a-c), de acuerdo con parcial desplazamiento de p27-D2 de Cdk2/ciclina A. Se utilizó un método radiométrico para analizar los espectros de RMN 2D TROSY-HSQC. En este método, la población relativa de las resonancias de estado libre (pf; para la resonancia de cada residuo de p27-D2) se determinó como una fracción de la intensidad total de las resonancias libres y enlazadas para un residuo dado. Estos valores se compararon formando la razón de las dos poblaciones relativas del estado libre (pfw/SJ403/pfw/o SJ403); valores superiores a 1 indicaron desplazamiento dependiente del compuesto. Las poblaciones relativas para el estado unido (pb) también se determinaron para muestras sin (pbw/o SJ403) y con SJ403 (pbw/SJ403). En este caso, las proporciones inferiores a 1 indicaron el desplazamiento de p27-D2 de Cdk2/ciclina A. Además, los valores de desplazamiento químico de las resonancias de estado libre reflejaron la unión de p27-D2 a SJ403 (Supl. Fig. 7d, e), además apoyando la conclusión de que SJ403 cambia el equilibrio de unión entre p27-D2 y Cdk2/ciclina A para aumentar la población de p27-D2 no unida a través de interacciones proteína:molécula pequeña.

Análisis 2D 1H-15N TROSY-HSQC NMR del desplazamiento de 15N-p27-D2 de Cdk2/ciclina A por SJ403.

Se registraron los espectros 2D 1H-15N TROSY-HSQC NMR de p27-D2/Cdk2/ciclina A en ausencia (control) y presencia de SJ403 (3 mM), respectivamente. Para los residuos informados, se observaron resonancias de p27-D2 libres y unidas en los espectros TROSY-HSQC. Se observó un aumento en la intensidad relativa de las resonancias libres de p27-D2 en el espectro TROSY-HSQC de p27-D2/Cdk2/ciclina A en presencia de SJ403, con respecto al espectro control (a), mientras que las resonancias de p27 -D2 unido a Cdk2/ciclina A mostró una disminución en la intensidad relativa (b). Esto permite el cálculo de poblaciones de p27-D2 libre (f) y unida (b), en ausencia (sin SJ403) y presencia de SJ403 (con SJ403)). Los valores de pfw/o SJ403 representan las poblaciones relativas de resonancias para p27-D2 libre antes de la adición de SJ403 y los valores de pfw/SJ403 son las poblaciones relativas de resonancias de p27-D2 en estado libre después de la adición de SJ403. En consecuencia, los valores de pbw/o SJ403 representan las poblaciones relativas de resonancias para p27-D2 unido a Cdk2/ciclina A antes de la adición de SJ403 y los valores de pbw/SJ403 son las poblaciones relativas de resonancias de p27-D2 en estado unido después de la adición de SJ403. Se muestran los valores medios y las desviaciones estándar de los medios para mediciones por triplicado; un conjunto de espectros 2D 1H-15N TROSY-HSQC por triplicado se ilustran en Supl. Figura 7.

Los resultados de FA y RMN indicaron que SJ403 desplazó parcialmente a p27-D2 de Cdk2/ciclina A; por lo tanto, a continuación investigamos si el desplazamiento moduló la actividad quinasa de Cdk2. p27-D2, aunque carece de los subdominios D1 y LH que se encuentran en p27-KID, sigue siendo un inhibidor moderadamente potente de Cdk2/ciclina A (valor IC50, 152 ± 39 nM; Supl. Fig. 9a). En condiciones en las que p27-D2 inhibió casi por completo Cdk2/ciclina A (se mantuvo ~13 % de la actividad de quinasa completa), la titulación de SJ403 en el rango de concentración mostrado en los experimentos de FA y NMR para causar el desplazamiento de p27-D2 condujo a un aumento de la quinasa. actividad (del 13 % al ~20 %, un aumento de >50 %; Fig. 6a y Supl. Fig. 9b), consistente con el desplazamiento parcial de p27-D2 de Cdk2/ciclina A por SJ403. Además, en ausencia de p27-D2, SJ403 inhibió sustancialmente la actividad de Cdk2/ciclina A en concentraciones que, en presencia de p27-D2, se asociaron con el desplazamiento de p27-D2 y aumentaron la actividad de la quinasa (Fig. 6b y suplemento 9c) . Por lo tanto, concluimos que el efecto principal de SJ403 es el desplazamiento de p27-D2 de Cdk2/ciclina A (a través de la unión de SJ403 a p27-D2) y la restauración parcial de la actividad quinasa, incluso como efecto secundario de SJ403 es inhibir la quinasa. actividad (mediante la unión de SJ403 a Cdk2/ciclina A). Estos resultados proporcionan una prueba de principio de que una molécula pequeña (SJ403) inhibe la función de una proteína alterada (p27-D2) a través del secuestro en una conformación incapaz de unirse e inhibir Cdk2/ciclina A.

La pequeña molécula SJ403 desplaza p27-D2 de Cdk2/ciclina A y restaura parcialmente la actividad de la quinasa Cdk2.

Análisis de la actividad de la quinasa Cdk2 [dentro del complejo Cdk2/ciclina A (200 pM) utilizando Histona H1 como sustrato] en presencia de p27-D2 (200 nM) y concentraciones variadas de SJ403 (de 10 μM a 3 mM) (a ) y concentraciones variadas de SJ403 solo (b). Cdk2 es parcialmente activo bajo las condiciones iniciales en (a) y la actividad se mejora mediante la adición de SJ403. En ausencia de p27-D2 (b), la adición de SJ403 se asocia con la inhibición de Cdk2. Todos los experimentos se realizaron por triplicado y se muestran los valores promedio y las desviaciones estándar de las medias.

Anteriormente mostramos en base a datos computacionales de dinámica molecular (MD) y RMN que p27-KID exhibe diferentes tipos de estructura secundaria parcialmente poblada en estado libre, incluida la estructura helicoidal dentro del subdominio LH, una conformación de horquilla β dentro de la subregión D2.1 y estructura helicoidal dentro de la subregión D2.3 del subdominio D2 (ref. 21; véase la Fig. 1a para la nomenclatura del subdominio/subregión). Curiosamente, las moléculas del Grupo 1 y 2 interactuaron de manera variable con dos de estas regiones parcialmente estructuradas de p27-KID (subregiones D2.1 y D2.3), pero también con la subregión D2.2, que es altamente dinámica y no no exhibir una estructura secundaria persistente21 (Fig. 7a-c); estos sitios de interacción están todos dentro del subdominio D2 de unión a Cdk2. En particular, las moléculas de unión a p27 no interactuaron con los subdominios D1 o LH. Es importante destacar que cada una de las regiones dentro de p27-KID que interactuó con moléculas pequeñas contenía varios aminoácidos aromáticos (Fig. 7a). De hecho, el subdominio D2 contiene ocho de los nueve aminoácidos aromáticos que se encuentran dentro de p27; un noveno, F33, se encuentra dentro del subdominio D1 pero se unió a moléculas pequeñas. Las moléculas del grupo 1 causaron los CSP más grandes para los residuos F87, Y88 e Y89 dentro de la subregión D2.3 y las moléculas del grupo 2 perturbaron las resonancias para estos residuos, así como para los residuos W60, N61 (subregión D2.1) y E75, W76 y Q77 (subregión D2.2). Los residuos de fenilalanina (F) o tirosina (Y) flanquean los residuos de triptófano (W), pero exhibieron valores de CSP más pequeños en presencia de compuestos del Grupo 2 que los residuos de W, lo que sugiere que las moléculas pequeñas perturbaron preferentemente el entorno electrónico de los anillos de indol. de estos residuos. Probamos esta hipótesis a través de la mutagénesis de W60 o W76, o ambos, dentro de p27-KID a F o alanina (A) y usamos 2D NMR para mapear la unión a SJ403. Las variantes de p27-KID mutantes individuales exhibieron patrones de CSP similares a los observados para p27-KID de tipo salvaje, excepto que las perturbaciones cerca de los residuos W mutados estaban ausentes (Supl. Fig. 5a, b, d, e). Sin embargo, las dos variantes p27-KID doblemente mutadas exhibieron solo CSP muy débiles dentro del grupo aromático F87YY89 (suplemento Fig. 5c, f). Juntos, estos resultados indicaron que cada uno de los dos residuos W, W60 y W76, contribuyeron sustancialmente a la unión a SJ403. Las mutaciones de F87, Y88 o Y89 a A se asociaron con CSP sustancialmente reducidos dentro de la región de unión del compuesto del Grupo 1 de p27-KID (Suplemento Fig. 5j-l), mientras que la mutación de R90 a A (Suplemento Fig. 5m) tuvo poco efecto sobre la unión, lo que implica que la agrupación de las cadenas laterales aromáticas es fundamental para la interacción molécula pequeña:proteína. Con el mutante Y88 a A p27-KID, el compuesto del Grupo 2, SJ403, causó CSP cerca de los dos residuos W (W60 o W76) pero no dentro de la región F87A88Y89 de p27-KID (Supl. Fig. 5h). Sin embargo, con los mutantes F87 a A e Y89 a A, SJ403 causó patrones de CSP similares a los observados con p27-KID de tipo salvaje (Supl. Fig. 5g, i), lo que sugiere que Y88 contribuye en mayor medida a las interacciones con SJ403. (y posiblemente otros compuestos del Grupo 2) que Y89.

Las moléculas pequeñas se unen a grupos de residuos aromáticos con el subdominio D2 de p27-KID.

(a) La secuencia de aminoácidos de p27-D2 que muestra el subdominio D2 y las regiones de unión de moléculas pequeñas individuales (marcadas como D2.1, D2.2 y D2.3). Los aminoácidos aromáticos dentro de estas regiones se ilustran en negrita. Estos representan ocho de los nueve residuos aromáticos dentro de p27-KID. ( b, c ) Valores promedio de perturbación de cambio químico de 1H para todos los compuestos del Grupo 1 (b) y Grupo 2 (c) que ilustran las preferencias por las interacciones con los residuos Y (b) y W e Y (c), respectivamente.

Los dos residuos W e Y88 de p27 se conservan en la proteína reguladora del ciclo celular desordenado relacionada, p21Waf1/Cip1 42 (p21; Fig. 8a), lo que permite probar más a fondo su dominio en las interacciones con los compuestos del Grupo 1 y 2 (Fig. 8b ,C). El compuesto del Grupo 2, SJ403, interactuó con residuos cerca de W49 y W65 de p21 (dentro del dominio inhibidor de la quinasa p21, p21-KID) pero no con Y77 (homólogo a Y88 de p27; Fig. 8c), lo que respalda la importancia de los residuos W para las interacciones con esta pequeña molécula, pero también sugiere que se requiere la agrupación de al menos dos residuos Y y F para interacciones adicionales. Los dos residuos de leucina (L) que flanquean a Y77 en p21 (L76 y L78) no sustituyen a F87 e Y89 en p27. De manera similar, la región L76YL78 de p21 no admite la unión a un compuesto del Grupo 1 (SJ319843; Fig. 8b). Estos hallazgos con p21-KID fortalecen aún más nuestra explicación de la base molecular de las interacciones de los compuestos del Grupo 1 y 2 con p27.

Interacción de p21-KID con fragmentos representativos de p27.

(a) Comparación de secuencias de aminoácidos de los subdominios D2 de p27-KID y p21-KID; ( b, c ) Perturbaciones de desplazamiento químico de 1H (ΔδHN) individuales (a través del análisis de espectros de RMN HSQC 2D 1H-15N) causadas por la adición de SJ319843 (b, Grupo 1) y SJ403 (c, Grupo 2), respectivamente, a 2H / 15N-p21-KID (20 μM). El umbral para identificar interacciones de unión específicas con los residuos de p27-KID se definió como dos desviaciones estándar por encima del promedio de las perturbaciones de desplazamiento químico (Δδave+2σ, representado como la línea negra punteada) y se consideró si las perturbaciones eran mayores que la resolución digital experimental 1H (mostrado como una línea magenta punteada).

Para obtener información sobre las características estructurales de los sitios de unión de moléculas pequeñas dentro de p27, realizamos simulaciones de dinámica molecular (MD) (más de 400 ns) con p27-D2. Los resultados recapitularon los hallazgos anteriores de MD (más de 100 ns) para la construcción p27-KID más larga21 que reveló una horquilla β transitoria que involucraba los residuos W60-F64 y H67-L70 (dentro de la subregión D2.1) y dos giros helicoidales α que involucraban residuos E80-G82 y F87-Y89 (dentro de la subregión D2.3). En la nueva trayectoria MD, estas estructuras secundarias eran estables en escalas de tiempo cortas de nanosegundos, pero se desplegaban y replegaban durante los períodos de tiempo más largos muestreados en este experimento. Estas transiciones de escala de tiempo más largas se combinaron con la formación transitoria de grupos hidrofóbicos que involucran residuos dentro de las subregiones D2.1 y 2.2 (que contienen W60 y W76) y la subregión D2.3 (que contiene Y88; Fig. 9a) que dio lugar a conformaciones extendidas y compactas (etiquetadas como E y C en la Fig. 9b). Los confórmeros extendidos y compactos representativos se presentan en la Fig. 9c y d, respectivamente, y todos los demás en Supl. Figura 10a,b. (Tenga en cuenta que los confórmeros se definen como compactos si dos de los tres residuos aromáticos de p27 críticos para unirse a moléculas pequeñas, W60, W76 e Y88, están a menos de 20 Å entre sí). Especulamos que las conformaciones extendidas y compactas crean unión sitios para compuestos del Grupo 1 y Grupo 2, respectivamente. Nuestra interpretación de estos resultados es que los compuestos del Grupo 1 se unen al motivo F87YY89 dentro de la subregión D2.3 en moléculas p27-D2 en las que Y88 está lejos de W60 y W76 (>20 Å) y que las moléculas del Grupo 2 se unen para compactar conformaciones cuando al menos dos de los tres residuos aromáticos críticos dentro de las diferentes subregiones (subdominios D2.1, D2.2 y D2.3) están agrupados. Curiosamente, el análisis de la trayectoria de MD mostró que Y88 y W60 o W76 estaban frecuentemente en contacto cercano, pero que los tres residuos rara vez estaban muy cerca (Supl. Fig. 10c). Esto sugirió que hay varias conformaciones diferentes con residuos aromáticos agrupados (en particular, Y88 y W60 o W76) capaces de unirse a los compuestos del Grupo 2, de acuerdo con los resultados de mutagénesis que muestran que W60 o W76, pero no ambos, son prescindibles para el Grupo Unión de 2 compuestos (Supl. Fig. 5a–f). En resumen, los nuevos resultados de MD para p27-D2 sugieren fuertemente que las fluctuaciones conformacionales transitorias que crean y alteran grupos de residuos aromáticos modulan la unión de las moléculas pequeñas del Grupo 1 y el Grupo 2 a p27-D2. Estos resultados son consistentes con la identificación de W60, W76 e Y88 por RMN como los sitios principales para la unión del compuesto y con los resultados que muestran que la unión se altera a través de la mutación de estos residuos.

Los perfiles de distancia de los átomos de Cβ W60, W76 e Y88 monitoreados en función del tiempo a partir de simulaciones MD revelan estados extendidos y compactos en el conjunto conformacional p27-D2.

(a) Distancia entre átomos de Cβ W60-W76 (izquierda), W60-Y88 (centro) y W76-Y88 (derecha) monitoreados a lo largo del tiempo desde MD con líneas grises que representan la distancia instantánea (cada 2 ps) y líneas rojas que representan el tiempo promedio (cada uno ns). Los tiempos en los que se extrajeron confórmeros representativos extendidos (E) y compactos (C) para mostrarlos en Supl. Fig. 10 se indican. (b) Ilustración de las distribuciones de las distancias en (a) mostradas como histogramas (líneas rojas). Las distribuciones muestran la existencia de dos estados distintos para W60-Y88 (centro) y W76-Y88 (derecha) que indican conformaciones compactas (C) y extendidas (E) (ver Supl. Fig. 10). ( c, d ) Conformaciones representativas extendidas ( c ) y compactas ( d ), respectivamente, que muestran las posiciones relativas de los residuos de p27-D2 involucrados en la interacción con los fragmentos.

El descubrimiento de fármacos contra proteínas plegadas a menudo implica la identificación de compuestos que se unen a sitios que se utilizan naturalmente para interacciones con ligandos de moléculas pequeñas o macromoleculares. Estos tipos de sitios de unión son temporalmente estables y permiten interacciones estrechas y específicas con moléculas pequeñas químicamente complementarias. Por el contrario, las proteínas desordenadas (o regiones de proteínas desordenadas) exhiben conformaciones dinámicas y heterogéneas que no muestran sitios de unión de moléculas pequeñas estables temporalmente y similares. Sin embargo, a pesar de la falta de una característica temporalmente estable, muchas proteínas/regiones desordenadas interactúan con socios macromoleculares a través del proceso de plegamiento tras la unión. Presumimos que la capacidad de una proteína desordenada para unirse a otras proteínas también conferiría la capacidad de unirse a moléculas pequeñas y probamos esta idea a través de los estudios de p27 descritos en este documento.

Toda la proteína p27 está desordenada y su dominio N-terminal (p27-KID) se ordena al unirse a Cdk2/ciclina A. Un motivo lineal corto dentro del subdominio D1 de p27-KID (con la secuencia R30NLFG34; L, leucina Supl. Fig. 11a,b) se une a un bolsillo en la superficie de la ciclina A. El subdominio LH, que une los subdominios D1 y D2, entra en contacto con las superficies de la ciclina A y Cdk2 pero contribuye poco a la energía de unión43. El subdominio D2 de p27 (p27-D2; 34 aminoácidos de longitud) adopta una estructura secundaria extensa y realiza interacciones hidrofóbicas extensas con Cdk2 al unirse (Supl. Fig. 11a, c y d). Además, se forman numerosos enlaces de hidrógeno entre residuos dentro del subdominio D2 y Cdk2. Si bien p27-D2 exhibe 11 residuos hidrofóbicos y aromáticos (incluidos los residuos I, L, V, F, W e Y), muchos de los cuales contribuyen a las interacciones con Cdk2, este subdominio no forma de forma independiente un núcleo hidrofóbico estable.

A pesar del extenso desorden en el estado no unido, identificamos dos grupos de moléculas pequeñas que se unen con una especificidad exquisita aunque con baja afinidad a dos regiones superpuestas dentro de p27. Estas moléculas se unen a regiones que contienen anillos aromáticos, con preferencia por los residuos W e Y. Las moléculas del Grupo 1 se unieron a una región localizada, F87YY89, mientras que las moléculas del Grupo 2 se unieron a esta región, así como a otras dos que contenían dos residuos W (W60 y W76). Sorprendentemente, las moléculas dentro de los Grupos 1 (25 moléculas) y 2 (14 moléculas), respectivamente, eran químicamente similares, lo que demuestra las relaciones de actividad de unión a la estructura química para estos dos tipos de interacciones de moléculas pequeñas: proteínas. Nos referimos a este fenómeno como "relaciones de actividad de estructura difusa (SAR)" debido al carácter "borroso" de los respectivos mapas de potencial de interacción (Fig. 3a, b).

Estas características químicas de las moléculas de unión a p27 pueden racionalizarse basándose en las características de los residuos dentro y que flanquean los sitios de unión identificados por RMN dentro de p27-D2. Las moléculas del grupo 1 y 2 exhibieron dos o tres anillos aromáticos heterocíclicos y exhibieron el potencial de que estos anillos participen en interacciones hidrofóbicas (Fig. 3a, b; polígonos dorados). Las moléculas en ambos grupos también mostraron el potencial de unirse a restos electropositivos (Fig. 3a,b; polígonos cian), de acuerdo con la región F87YY89 en los sitios de unión del Grupo 1/2 flanqueados en el extremo C-terminal por R90PPR93 y W60 en el El sitio de unión del grupo 2 está flanqueado en el extremo N-terminal por R58K59. El residuo W76 dentro del sitio de unión del Grupo 2 está flanqueado por aminoácidos con características electronegativas y electropositivas, así como polares (E71GKYEW76QEVEK81), aunque el potencial de interacciones con restos electronegativos solo se representó débilmente (Fig. 3b; polígonos rojos). Además de las características electrostáticas, las moléculas pequeñas, que exhiben donantes y aceptores de enlaces de hidrógeno, pueden lograr especificidad a través de enlaces de hidrógeno transitorios con grupos complementarios dentro de p27-D2, como se observa en las moléculas pequeñas que se unen a Myc44. Argumentamos que estas y otras características actualmente no apreciadas de la cadena polipeptídica p27-D2 crean el potencial para unirse específicamente a las moléculas pequeñas del Grupo 1 y 2.

¿Cuáles son las características conformacionales de los sitios de unión de moléculas pequeñas dentro de p27? Nuestros cálculos MD con p27-D2 revelaron fluctuaciones dinámicas de distancias por pares entre los residuos aromáticos (específicamente, W60, W76 e Y88) dentro de los sitios de unión del Grupo 2 (Fig. 9). Mientras que W60 y W76 muestrearon un rango de distancia relativamente estrecho (16,5 ± 2,3 Å), las distancias entre W60 e Y88 y W76 e Y88 fluctuaron en un rango más amplio (20,5 ± 5,5 Å y 19,6 ± 4 Å, respectivamente). Además, estas últimas distancias de pares de residuos exhibieron cada una dos poblaciones discretas que denominamos compactas (C) y extendidas (E; Fig. 9b, paneles central y derecho). Proponemos que las conformaciones compactas creen sitios de unión para los compuestos del Grupo 2, de acuerdo con los patrones de NMR CSP (Fig. 7c). Además, proponemos que las conformaciones extendidas favorecen la unión de los compuestos del Grupo 1 a la región F87YY89, también de acuerdo con los patrones de RMN CSP (Fig. 7b). W60 está flanqueado por F62 y F64 y W76 por Y74, pero los resultados de la mutagénesis (Supl. Fig. 5a-f) sugirieron que los residuos W son los principales determinantes de la unión del compuesto del Grupo 2. Esto probablemente se deba al potencial de las cadenas laterales de los residuos W e Y (pero no de los residuos F) para formar enlaces de hidrógeno con moléculas pequeñas, además de participar en interacciones hidrofóbicas y de apilamiento π. Curiosamente, el análisis de correlación de distancia (Supl. Fig. 10c) indicó que, en las conformaciones compactas, Y88 está más frecuentemente cerca de W60 o W76 pero rara vez cerca de ambos residuos W. Esto sugirió que la proximidad cercana de Y88 y uno u otro de los dos residuos W crearon sitios de unión dentro de p27-D2 para los compuestos del Grupo 2. Esta observación también es consistente con los resultados de la mutagénesis, que mostraron que la mutación de ambos residuos W, pero no de los residuos W individuales, anuló la unión a los compuestos del Grupo 2 (Supl. Fig. 5c, f versus a, b, d, e). En resumen, p27-D2 exhibió contactos cercanos transitorios entre W60 o W76 e Y88, lo que proponemos crea sitios de unión para los compuestos del Grupo 2. Además, cuando ni el residuo W ni Y88 están cerca, la proximidad espacial de los tres residuos aromáticos en la región F87YY89 creó sitios de unión para los compuestos del Grupo 1. Es interesante que, en la estructura unida a Cdk2/ciclina A de p27-KID34, los cinco residuos aromáticos dentro de las subregiones D2.1 y D2.2 (que se unen a los compuestos del Grupo 2) están muy cerca (pero separados de la región F87YY89, Fig. Suplementaria 11a, c y d). Los resultados de MD muestran que, en ausencia de Cdk2/ciclina A, subconjuntos de estos ocho residuos aromáticos interactúan transitoriamente, a veces creando sitios de unión para diferentes tipos de moléculas pequeñas aromáticas heterocíclicas (Grupo 1 o 2).

Se demostró que el compuesto, SJ403, secuestra p27-D2 lejos de Cdk2/ciclina A y activa la actividad catalítica de Cdk2, cumpliendo efectivamente nuestro objetivo de inhibir la función inhibidora del ciclo celular de p27. Si bien la afinidad de las moléculas del Grupo 1 y 2 es baja, exhiben una alta especificidad por regiones particulares de p27. Como se discutió anteriormente, los residuos dentro de estas regiones se involucran con Cdk2. Sorprendentemente, los > 2300 compuestos que se seleccionaron no lograron unirse a otras regiones de p27 (subdominios D1 y LH), lo que sugiere que estas otras regiones carecen de una densidad suficiente de residuos aromáticos (específicamente, residuos W e Y) para reconocer específicamente heterocíclicos pequeños. moléculas aromáticas. El subdominio LH, de forma aislada, no se une a Cdk2/ciclina A, pero el subdominio D1 se une a la ciclina A con alta afinidad (Kd, 42 nM)45. Especulamos que el motivo RxLFG dentro de esta última región, debido a su longitud limitada, no puede adoptar conformaciones que creen bolsillos de unión para moléculas pequeñas, como es posible para el subdominio D2 mucho más largo. Sin embargo, la baja afinidad de los compuestos del Grupo 1 y 2 por p27 limita su aplicabilidad hacia nuestro objetivo más amplio de modular la función de p27 en las células y, en última instancia, en los seres humanos. ¿Cómo se puede aumentar la afinidad de las moléculas pequeñas por p27? Proponemos que las moléculas del Grupo 1 y 2 provocan un grado de restricción conformacional dentro de p27-D2 y que las moléculas que mejoran esta restricción exhibirán una mayor afinidad. Prevemos que las moléculas pequeñas con mayor "tridimensionalidad", que presentan características químicamente diversas y complejas, serán mejores plantillas para unir y secuestrar p27. Se están realizando esfuerzos basados en dos estrategias para optimizar nuestros éxitos de fragmentos utilizando química sintética. Primero, estamos "creciendo" los andamios del Grupo 1 y 2 mediante la introducción de diversos restos químicos en varias posiciones en los sistemas de anillos heterocíclicos para permitir interacciones adicionales con residuos cerca de W60, W76 e Y88 dentro de p27-D2. En segundo lugar, cuando se completen los experimentos de crecimiento, "enlazaremos" sintéticamente las moléculas óptimas del Grupo 1 y el Grupo 2 para mejorar aún más la unión a p27-D2. Los resultados de estos futuros experimentos indicarán si las estrategias sintéticas para la optimización de compuestos que han surgido del descubrimiento de fármacos basados en la estructura se pueden aplicar a una proteína desordenada. En conclusión, hemos descubierto pequeñas moléculas con "SAR borroso" que median la unión específica y la inhibición de p27, lo que demuestra el potencial para "medicar" racionalmente los objetivos de proteínas desordenadas en el futuro.

Las construcciones de p27 se expresaron en E. Coli con una etiqueta de afinidad 6xHis N-terminal después de la subclonación en pET28a (Novagen) usando procedimientos establecidos20. Esto incluía p27-KID (restos 22-105 de p27 humana) y los siguientes mutantes: W60A, W60F, W76A, W76F, W60A-W76A, W60F-W76F, F87A, Y88A, Y89A y R90A. p27-D2 (residuos 58-105 de p27 humana) y el mutante, C99S-R93C, se expresaron de manera similar. Las proteínas marcadas con isótopos (15N, 13C/15N y 2H/13C/15N) se expresaron en un medio mínimo basado en MOPS utilizando procedimientos establecidos22. Todas las construcciones de p27 se purificaron mediante cromatografía de afinidad con níquel, se digirieron con trombina para eliminar la etiqueta 6xHis y se purificaron aún más mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) de fase inversa utilizando una columna C4 (Vydac) y disolvente de agua/acetonitrilo que contenía ácido trifluoroacético al 0,1 %. sistema. Las concentraciones de proteína se determinaron por absorbancia UV a 280 nm utilizando un coeficiente de extinción molar de 15 470 M−1 cm−1 para p27-KID, p27-KID-F87A, p27-KID-R90A, p27-D2 y p27-D2-C99S- R93C; 13980 M−1cm−1 para p27-KID-Y88A y p27-KID-Y89A; 9.970 M-1 cm-1 para variantes de p27-KID con un único residuo de triptófano; y 4470 M-1 cm-1 para las variantes de p27-KID sin residuo de triptófano. La Cdk2 humana completa, la Cdk2 activa (fosforilada en treonina 160), la ciclina A humana truncada (residuos 173–432) y p21-KID se expresaron y purificaron mediante protocolos establecidos20,46.

El complejo Cdk2/ciclina A se preparó equilibrando Cdk2 y ciclina A (proporción molar 1:1) durante 1 hora a 4 °C seguido de purificación mediante cromatografía de exclusión por tamaño (resina S75, GE Healthcare, Piscataway, NJ) en tampón que contenía 20 Tris mM, pH 7,5, NaCl 200 mM, TCEP 5 mM). El complejo ternario se preparó equilibrando 2H/13C/15N-p27-D2 con Cdk2/ciclina A (proporción molar 1,1:1) a 4 °C durante la noche seguido de purificación mediante cromatografía de exclusión por tamaño (resina S200, GE Healthcare, Piscataway, NJ ) en el mismo tampón que el complejo Cdk2/ciclina A. Para los experimentos de RMN, el complejo 2H/13C/15N-p27-D2/Cdk2/ciclina A se intercambió con tampón en fosfato de Na 20 mM, pH 6,5, NaCl 200 mM, DTT-D10 10 mM y 2H2O al 10 %.

La biblioteca de fragmentos utilizada para detectar la unión a p27-KID estaba compuesta por dos colecciones que se diseñaron de acuerdo con diferentes criterios: (a) se compraron 1100 fragmentos de Maybridge Ro3 Diversity Fragment Library ("Maybridge")47 y (b) 1222 los fragmentos se adquirieron de Enamine (N = 250) y Life Chemicals (N = 972) usando un algoritmo interno ("In-House").

La colección de fragmentos de Maybridge se diseñó para proporcionar una amplia cobertura del espacio químico para el descubrimiento de fármacos basados en fragmentos. Cada fragmento satisface la regla de tres de Congreve40: (a) peso molecular < 300; (b) número de donantes de enlaces de hidrógeno ≤ 3; c) número de aceptores de enlaces de hidrógeno ≤ 3; y (d) clogP ≤ 3. Todos los compuestos tienen una solubilidad de equilibrio determinada experimentalmente ≥200 mM (DMSO) y ≥1 mM (PBS) y una pureza confirmada ≥95 % (según el análisis por cromatografía líquida/espectrometría de masas) y están libres de reactivos. o grupos funcionales tóxicos. Los 1.100 fragmentos constituyen un conjunto 'básico' que abarca la diversidad química de toda la colección (1.823 fragmentos).

La colección de fragmentos internos consta de 1222 compuestos disponibles comercialmente seleccionados mediante un algoritmo personalizado diseñado para identificar moléculas estructuralmente complejas y de bajo peso molecular con andamios que se muestrearon bien dentro de la biblioteca separada de detección de alto rendimiento de St. Jude (biblioteca HTS, >500.000 compuestos; ver más abajo). En primer lugar, se filtraron colecciones de fragmentos comerciales (subconjuntos de colecciones de mayor diversidad filtradas por características "similares a fragmentos") para eliminar moléculas que contenían átomos inorgánicos, isótopos o estructuras no válidas y para eliminar moléculas que no estaban disponibles en cantidad suficiente (<50 mg) . Las moléculas que pasaban se extrajeron a los andamios de Murcko utilizando Pipeline Pilot (componente 'Generar fragmentos' en Accelrys v. 8.5 con átomos alfa conservados, consulte la ref. 48 para conocer el método general). Estos andamios se filtraron aún más de acuerdo con las siguientes reglas: número de subestructuras reactivas = 0 (filtros 'REOS'49,50,51, número de enlaces giratorios <= 3, número de átomos pesados >= 10, número de anillos> = 1 y número de sustituciones de anillo >1 para sistemas de un solo anillo y número de moléculas presentes en la biblioteca St. Jude HTS que contiene el andamio >= 8. Las moléculas que contienen estos andamios se identificaron en las bibliotecas de fragmentos comerciales y luego se priorizaron para su compra de acuerdo con la mayor complejidad de Oprea52 Esta biblioteca tiene las siguientes propiedades fisicoquímicas promedio calculadas: PM = 246 ± 39 Da, número de átomos = 17 ± 3, log P = 1,7 ± 1,0, área de superficie polar = 63 ± 19 Å2, número de aceptores de enlaces H = 4,3 ± 1, 4 y número de donantes de enlaces H = 1, 3 ± 0, 9. Las distribuciones de estas y otras características químicas de las dos bibliotecas de fragmentos se resumen en la Fig. Suplementaria 12a.

Los mapas de campo de consenso para las moléculas del Grupo 1 y 2 se definieron mediante el módulo FieldTemplater en Forge (v10, Cresset, REF= http://www.cresset-group.com/products/forge/accessedDec2014). El módulo FieldTemplater toma como entrada un conjunto de moléculas de referencia (los compuestos activos para los Grupos 1 y 2 identificados en las dos primeras rondas de evaluación; Tabla complementaria 1A, B) y busca alinearlos para maximizar la superposición entre sus campos de interacción. . Las moléculas de referencia se alinean primero usando puntos de campo, seguido de una optimización más lenta y precisa de la alineación usando el campo de interacción completo. Antes de la alineación, las conformaciones se generaron utilizando la opción de búsqueda de conformación 'Muy precisa y lenta' en Forge y la configuración predeterminada. La función de puntuación de similitud utilizada en la alineación se basó en un 100 % de similitud de campo y un 0 % de similitud de forma para maximizar la diversidad topológica de moléculas recuperadas utilizando el modelo en la siguiente ronda de selección.

Los mapas de campo de consenso para las moléculas del Grupo 1 y 2 se usaron para consultar una base de datos de 10 455 moléculas similares a fragmentos de ChemDiv (www.chemdiv.com) usando el módulo FIeldScreen en Forge. De las 215 moléculas con las puntuaciones de similitud de campo más altas, se compraron 184 compuestos. Sin embargo, 106 de estos eran poco solubles en las condiciones de nuestro ensayo y no se examinaron. De los 78 compuestos restantes, se identificaron 12 aciertos adicionales usando 2D 1H-15N HSQC NMR (ver más abajo).

Los experimentos de RMN de selección y validación se realizaron a 298 K (25 °C) utilizando un espectrómetro Varian Inova de 600 MHz equipado con una sonda de gradiente de temperatura ambiente de triple resonancia (HCN) o un espectrómetro Bruker Avance de 600 MHz equipado con una sonda de gradiente criogénico TCI y un Cambiador de muestras SampleJet. Las moléculas de fragmento se analizaron inicialmente como grupos de cinco moléculas disueltas a 10 mM cada una en DMSO-D6. Los conjuntos de fragmentos contenidos en placas de 96 pocillos se mezclaron utilizando un manipulador de líquidos Gilson 215 con tampón (fosfato de Na 20 mM, pH 6,5, NaCl 20 mM, 2H2O al 10 %, DTT-D10 5 mM) o tampón que contenía la proteína p27-KID (p27-KID 10 μM) para dar concentraciones finales de compuesto de 200 μM cada una. Para los experimentos iniciales de cribado de fragmentos, se registraron espectros unidimensionales (1D) 1H- y WaterLOGSY35 NMR para conjuntos de compuestos sin y con proteína. Los grupos que presentaban aciertos se desconvolucionaron mediante el análisis de compuestos puros usando 1D 1H y se validaron mediante experimentos de RMN heteronuclear bidimensional (2D) (titulaciones 2D 1H-15N HSQC) usando el espectrómetro Bruker Avance de 600 MHz. Las muestras de RMN utilizadas para valoraciones 2D 1H-15N HSQC contenían 100 μM de proteína p27 marcada con 15N (p27-KID, p27-KID mutantes o p27-D2) en fosfato de Na 20 mM, pH 6,5, NaCl 200 mM, 2H2O al 10 %, DTT-D10 5 mM; los compuestos disueltos en DMSO-D6 se titularon a las concentraciones deseadas. Se añadió DMSO-D6 para mantener una concentración constante (2% vol/vol). Se logró una resolución espectral de 3,5 y 5,7 Hz en las dimensiones 1H y 15N, respectivamente. El triptófano y la tirosina, respectivamente, se titularon en 15N-p27-KID (100 μM) hasta 3 mM. Los experimentos tridimensionales (3D) de triple resonancia de la columna vertebral para establecer las asignaciones de resonancia para las construcciones de p27 se realizaron utilizando el espectrómetro Bruker Avance de 600 MHz. Las asignaciones para p27-KID y p27-D2 se ilustran en Supl. Fig. 12b, c y d, e, respectivamente. Los experimentos 2D 1H-15N TROSY-HSQC NMR con 2H/13C/15N-p27-D2/Cdk2/ciclina A y SJ403 se registraron a 308 K (35 °C). Se registraron experimentos 2D 1H-15N HSQC de hits de fragmentos representativos (1 mM de SJ319843, grupo 1 y SJ403, grupo 2, respectivamente) con 15N-p21-KID (20 μM) a 298 K usando un espectrómetro Bruker Avance de 600 MHz. Los espectros de RMN se procesaron con el software Bruker Topspin y se analizaron con el software de asignación de resonancia asistida por computadora (CARA)53.

Las perturbaciones de desplazamiento químico generalmente se cuantifican como valores de desplazamiento químico 1H y 15N combinados. Sin embargo, el análisis de datos primarios para moléculas pequeñas que se unen a p27 mostró que los CSP más grandes eran para la dimensión 1H, que eran estadísticamente significativos y que los valores de CSP 15N correspondientes a menudo eran pequeños y no significativos. Por lo tanto, el uso de valores de desplazamiento químico combinados enmascararía los efectos de la unión del compuesto. También consideramos rigurosamente la magnitud de los CSP en relación con la resolución digital experimental de las dimensiones 1H y 15N de los espectros HSQC y un umbral definido como el valor promedio de CSP más dos veces la desviación estándar de la media (Δδpromedio + 2σ). Por lo tanto, la evaluación de la significación estadística se basó en si un valor CSP particular era mayor que i) la resolución espectral experimental en la dimensión dada (1H o 15N) y ii) la cantidad, Δδpromedio + 2σ, para esa dimensión.

Se registraron titulaciones de dieciséis puntos de aciertos de fragmentos representativos del Grupo 1 y el Grupo 2 (SJ572710 y SJ572403, respectivamente) en 15N-p27-KID (100 μM) utilizando un HISQC 2D 1H-15N "en fase" adoptado con desacoplamiento de protones durante 15N etiquetado de desplazamiento químico logrado con un pulso compuesto WALTZ16 con una amplitud de 7,1 kHz54,55. Todos los experimentos se recogieron en un espectrómetro Bruker Avance de 800 MHz equipado con una sonda de gradiente criogénico TCI. Se usaron las siguientes relaciones molares de 15N-p27-KID (100 μM) a inhibidor: 1:0, 1:0,1, 1:1,5, 1:3, 1:4,5, 1:6, 1:7,5, 1:9 , 1:10.5, 1:12, 1:15, 1:18, 1:21, 1:24, 1:27 y 1:30. Cada espectro se registró con 256 (t1,max = 31,0 ms) y 1024 (t2,max = 106,5 ms) puntos complejos en las dimensiones 15N y 1H, respectivamente, con ocho transitorios recogidos por punto. La resolución espectral de las dimensiones 1H y 15N fue de 2,4 y 1,7 Hz, respectivamente. Las perturbaciones de desplazamiento químico a lo largo de toda la titulación tenían que ser mayores que este umbral de resolución para ser consideradas para análisis posteriores. Los datos se procesaron con el paquete NMRPipe56 y se analizaron con scripts internos escritos en Python utilizando las bibliotecas informáticas Scipy y Mathematica (Wolfram Research). Para aliviar el sesgo humano en la determinación de la posición del pico, se utilizó la función de selección automática de picos en NMRpipe en la que se asignó una ventana espectral para cada resonancia en toda la trayectoria de la titulación para un cambio químico determinado. El error en la posición del pico para una resonancia dada se tomó como el ancho de línea de 15N o 1HN dividido por la relación señal-ruido. Todas las resonancias que exhibieron perturbaciones de desplazamiento químico mayores que las resoluciones espectrales y Δδave + 2σ se agruparon posteriormente y ajustaron globalmente para su respectiva diferencia máxima de desplazamiento químico y una constante de disociación global (Kd). El error en los valores de Kd se determinó utilizando un enfoque Monte-Carlo en el que se impuso un error del 10 % en la concentración del ligando y se consideró el error en la posición del pico del desplazamiento químico.

El mutante p27-D2-C99S-R93C se conjugó con Alexa Fluor488-C5-Maleimide (Life Technologies, p27-D2-FL) en tampón que contenía fosfato de Na 20 mM, pH 7,3, NaCl 20 mM según el protocolo del fabricante. La proteína conjugada se purificó adicionalmente mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) de fase inversa utilizando una columna C4 (Vydac) y un sistema disolvente de agua/acetonitrilo que contenía ácido trifluoroacético al 0,1%. Las fracciones de HPLC liofilizadas se resuspendieron en tampón que contenía fosfato de Na 20 mM, pH 7, NaCl 200 mM, TCEP 3,5 mM. Las medidas de anisotropía de fluorescencia se realizaron a 25 °C en un espectrofluorómetro Horiba Fluorolog 3. Brevemente, p27-D2-FL (20 nM) se mezcló con Cdk2/Ciclina A (300 nM) y se añadió a la cantidad requerida de compuesto liofilizado (SJ403). Todas las muestras se incubaron durante la noche en la oscuridad a 4 °C antes de las mediciones de fluorescencia. Los datos de unión de anisotropía de fluorescencia se analizaron utilizando KaleidaGraph. El ajuste de la curva se realizó en el promedio de tres experimentos independientes mediante un modelo de enlace de regresión no lineal.

Se mezcló Cdk2/ciclina A (200 pM) con histona H1 (15 μM; EMD Millipore), p27-D2 (200 nM) y cantidades variadas de SJ403 liofilizado y se incubó durante la noche a 4 °C. El efecto del compuesto SJ403 sobre la actividad de Cdk2 se determinó realizando experimentos similares en ausencia de p27-D2. Posteriormente, se añadió ATP (concentración total de 50 μM, de los cuales 6 μCi γ 32P-ATP (PerkinElmer, Inc)) a cada reacción y se incubó adicionalmente durante 35 minutos a 30 °C. Cada reacción tenía un volumen total de 20 μL. El tampón de muestra contenía HEPES 20 mM pH 7,3, β-glicerolfosfato de sodio 25 mM, MgCl2 15 mM, EGTA 16 mM, Na3VO4 0,5 mM y DTT 10 mM. Las reacciones se extinguieron mediante la adición de tampón de carga de gel SDS (5 μL) y luego se analizaron mediante SDS-PAGE (10 μL). Los geles se secaron a 70 °C al vacío y se usó un fosfoimager (GE Healthcare, Piscataway, NJ) para cuantificar las bandas de 32P-Histone H1. Los valores de IC50 se determinaron mediante el ajuste de curvas utilizando el software KaleidaGraph. Los experimentos se realizaron por triplicado y la media de IC50 y se informan las desviaciones estándar de los valores medios.

Se utilizaron simulaciones MD de todos los átomos utilizando el software AMBER 12 optimizado para la unidad de procesamiento de gráficos (GPU)57 para explorar el panorama conformacional del dominio p27-D2. La conformación de p27-D2 dentro de la estructura p27-KID/Cdk2/ciclina A (PDB ID, 1JSU) se utilizó como estructura inicial a partir de cálculos MD con estados de protonación de aminoácidos modificados para reflejar un pH de 7,0. La estructura se colocó en una caja rectangular de agua TIP3P que era 15 Å más grande en todos los lados que la molécula p27-D2. Además de neutralizar el sistema mediante la adición de contraiones, se agregó NaCl 20 mM para imitar las condiciones experimentales en nuestras simulaciones.

El sistema se equilibró y estabilizó utilizando la minimización de energía de varios pasos a 298 K, como se describió anteriormente58. Todas las corridas de producción se realizaron utilizando el conjunto de número constante de partículas, volumen y energía (NVE) con condiciones de contorno periódicas. Se usó el método Ewald de malla de partículas (PME) para las interacciones electrostáticas y se usó un corte de 10 Å para las interacciones de Lennard-Jones. El algoritmo SHAKE se utilizó para restringir los movimientos de todos los átomos de hidrógeno unidos covalentemente. Las simulaciones se realizaron a 298 K y 1 atm de presión. La escala de tiempo total para nuestra simulación fue de 0,4 microsegundos con instantáneas almacenadas cada 2 ps, lo que da como resultado un total de 200 000 instantáneas de la trayectoria.

Cómo citar este artículo: Iconaru, LI et al. Descubrimiento de moléculas pequeñas que inhiben la proteína desordenada, p27Kip1. ciencia Rep. 5, 15686; doi: 10.1038/srep15686 (2015).

van der Lee, R. et al. Clasificación de regiones y proteínas intrínsecamente desordenadas. Chem Rev 114, 6589–6631 (2014). Pmc4095912.

Artículo CAS Google Académico

Gsponer, J., Futschik, ME, Teichmann, SA y Babu, MM Regulación estricta de proteínas no estructuradas: desde la síntesis de transcripciones hasta la degradación de proteínas. Ciencia 322, 1365–1368 (2008).

Artículo CAS ANUNCIOS Google Académico

Vavouri, T., Semple, JI, Garcia-Verdugo, R. & Lehner, B. El trastorno de proteína intrínseca y la promiscuidad de interacción están ampliamente asociados con la sensibilidad a la dosis. Celda 138, 198–208 (2009).

Artículo CAS Google Académico

Druker, BJ y col. Efectos de un inhibidor selectivo de la tirosina quinasa Abl sobre el crecimiento de células positivas para Bcr-Abl. Medicina natural 2, 561–566 (1996).

Artículo CAS Google Académico

Parque, CM et al. Descubrimiento de un inhibidor de molécula pequeña biodisponible por vía oral de las proteínas del linfoma 2 de células B prosupervivencia. J Med Chem 51, 6902–6915 (2008).

Artículo CAS Google Académico

Souers, AJ et al. ABT-199, un inhibidor potente y selectivo de BCL-2, logra una actividad antitumoral al mismo tiempo que ahorra plaquetas. Medicina natural 19, 202–208 (2013).

Artículo CAS Google Académico

Krishnan, N. et al. Dirigirse al extremo C desordenado de PTP1B con un inhibidor alostérico. Nat Chem Biol 10, 558–566 (2014). Pmc4062594.

Artículo CAS Google Académico

Erkizan, HV et al. Una pequeña molécula que bloquea la interacción de la proteína oncogénica EWS-FLI1 con la ARN helicasa A inhibe el crecimiento del sarcoma de Ewing. Nat Med 15, 750–756 (2009). Pmc2777681.

Artículo CAS Google Académico

Selvanathan, SP et al. La proteína de fusión oncogénica EWS-FLI1 es un centro de red que regula el empalme alternativo. Proc Natl Acad Sci USA 112, E1307–1316 (2015).

Artículo CAS Google Académico

Yin, X., Giap, C., Lazo, JS & Prochownik, EV Inhibidores de bajo peso molecular de la interacción y función Myc-Max. Oncogen 22, 6151–6159 (2003).

Artículo CAS Google Académico

Follis, AV, Hammoudeh, DI, Wang, H., Prochownik, E. & Metallo, SJ Razón estructural para la unión y el despliegue acoplados de la oncoproteína c-Myc por moléculas pequeñas. Química y Biología 15, 1149–1155 (2008).

Artículo CAS Google Académico

Hammoudeh, DI, Follis, AV, Prochownik, EV y Metallo, SJ Múltiples sitios de unión independientes para inhibidores de molécula pequeña en la oncoproteína c-Myc. J Am Chem Soc 131, 7390–7401 (2009).

Artículo CAS Google Académico

Toth, G. et al. Dirigirse al conjunto estructural intrínsecamente desordenado de alfa-sinucleína por moléculas pequeñas como una posible estrategia terapéutica para la enfermedad de Parkinson. PLoS One 9, e87133 (2014). Pmc3925190.

Artículo ANUNCIOS Google Académico

Convertino, M., Vitalis, A. & Caflisch, A. Unión desordenada de moléculas pequeñas a Abeta (12–28). J Biol Chem 286, 41578–41588 (2011). Pmc3308868.

Artículo CAS Google Académico

Jin, F., Yu, C., Lai, L. y Liu, Z. Nubes de ligandos alrededor de nubes de proteínas: un escenario de unión de ligandos con proteínas intrínsecamente desordenadas. PLoS Comput Biol 9, e1003249 (2013). Pmc3789766.

Artículo ANUNCIOS Google Académico

Hajduk, PJ & Greer, J. Una década de diseño de fármacos basado en fragmentos: avances estratégicos y lecciones aprendidas. Nat Rev Drug Discov 6, 211–219 (2007).

Artículo CAS Google Académico

Shuker, SB, Hajduk, PJ, Meadows, RP y Fesik, SW Descubrimiento de ligandos de alta afinidad para proteínas: SAR por RMN. Ciencia 274, 1531–1534 (1996).

Artículo CAS ANUNCIOS Google Académico

Dalvit, C. Métodos de RMN en la detección de fragmentos: teoría y comparación con otras técnicas biofísicas. Drug Discov Today 14, 1051–1057 (2009).

Artículo CAS Google Académico

Mitrea, DM & Kriwacki, RW Despliegue regulado de proteínas en la señalización. FEBS Lett 587, 1081–1088 (2013).

Artículo CAS Google Académico

Lacy, ER et al. p27 se une a complejos de ciclina-CDK a través de un mecanismo secuencial que implica el plegamiento de proteínas inducido por la unión. Nat Struct Mol Biol 11, 358–364 (2004).

Artículo CAS Google Académico

Sivakolundu, SG, Bashford, D. & Kriwacki, RW p27Kip1 desordenado exhibe una estructura intrínseca que se asemeja a la conformación unida a Cdk2/ciclina A. J Mol Biol 353, 1118–1128 (2005).

Artículo CAS Google Académico

Grimmler, M. et al. La actividad inhibidora de Cdk y la estabilidad de p27Kip1 están directamente reguladas por tirosina quinasas oncogénicas. Celda 128, 269–280 (2007).

Artículo CAS Google Académico

Galea, CA et al. Papel de la flexibilidad intrínseca en la transducción de señales mediada por el regulador del ciclo celular, p27 Kip1. J Mol Biol 376, 827–838 (2008). 2350195.

Artículo CAS Google Académico

Liang, J. et al. PKB/Akt fosforila p27, altera la importación nuclear de p27 y se opone a la detención de G1 mediada por p27. Nat. Medicina. 8, 1153–1160 (2002).

Artículo CAS Google Académico

Shin, I. et al. PKB/Akt media la progresión del ciclo celular mediante la fosforilación de p27(Kip1) en la treonina 157 y la modulación de su localización celular. Nat Med 8, 1145–1152 (2002).

Artículo CAS Google Académico

Viglietto, G. et al. Relocalización citoplasmática e inhibición del inhibidor de quinasa dependiente de ciclina p27 (Kip1) por fosforilación mediada por PKB/Akt en cáncer de mama. Nat. Medicina. 8, 1136–1144 (2002).

Artículo CAS Google Académico

Zhao, H. et al. La mala localización de p27 en el citoplasma de las células de cáncer de mama confiere resistencia a la terapia dirigida anti-HER2. Oncotarget 5, 12704–12714 (2014).

Académico de Google de PubMed

Chen, P. & Segil, N. p27(Kip1) vincula la proliferación celular con la morfogénesis en el órgano en desarrollo de Corti. Desarrollo 126, 1581–1590 (1999).

CAS PubMed Google Académico

White, PM, Doetzlhofer, A., Lee, YS, Groves, AK y Segil, N. Las células de soporte cocleares de mamíferos pueden dividirse y transdiferenciarse en células ciliadas. Naturaleza 441, 984–987 (2006).

Artículo CAS ANUNCIOS Google Académico

Walters, BJ y col. La eliminación específica de células ciliadas auditivas de p27Kip1 en ratones posnatales promueve la generación autónoma de células ciliadas nuevas y una audición normal. J Neurosci 34, 15751–15763 (2014). Pmc4236404.

Artículo Google Académico

Walters, BJ y col. El cribado de alto rendimiento revela alsterpaulona, 2-cianoetilo como un potente inhibidor transcripcional de p27Kip1. PLoS One 9, e91173 (2014). Pmc3960108.

Artículo ANUNCIOS Google Académico

Sherr, CJ & Roberts, JM Inhibidores de CDK: reguladores positivos y negativos de la progresión de la fase G1. Genes y desarrollo 13, 1501–1512 (1999).

Artículo CAS Google Académico

Schulman, BA, Lindstrom, DL y Harlow, E. Reclutamiento de sustrato para la quinasa 2 dependiente de ciclina mediante un sitio de acoplamiento multipropósito en ciclina A. Proc Natl Acad Sci USA 95, 10453–10458 (1998). Pmc27915.

Artículo CAS ANUNCIOS Google Académico

Russo, AA, Jeffrey, PD, Patten, AK, Massague, J. y Pavletich, NP Estructura cristalina del inhibidor de quinasa dependiente de ciclina p27Kip1 unido al complejo ciclina A-Cdk2. Naturaleza 382, 325–331 (1996).

Artículo CAS ANUNCIOS Google Académico

Dalvit, C., Fogliatto, G., Stewart, A., Veronesi, M. & Stockman, B. WaterLOGSY como método para la detección primaria de RMN: aspectos prácticos y rango de aplicabilidad. Revista de RMN biomolecular 21, 349–359 (2001).

Artículo CAS Google Académico

Mayer, M. & Meyer, B. Caracterización de la unión de ligandos mediante espectroscopia de RMN de diferencia de transferencia de saturación. Angew. química En t. ed. 38, 1784–1788 (1999).

3.0.CO;2-Q" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F%28SICI%291521-3773%2819990614%2938%3A12%3C1784%3A%3AAID-ANIE1784%3E3.0.CO%3B2-Q" aria-label="Article reference 36" data-doi="10.1002/(SICI)1521-3773(19990614)38:123.0.CO;2-Q">Artículo CAS Google Académico

Surade, S. & Blundell, TL Biología estructural y descubrimiento de fármacos de dianas difíciles: los límites de la ligabilidad. Chem Biol 19, 42–50 (2012).

Artículo CAS Google Académico

Scott, DE, Coyne, AG, Hudson, SA y Abell, C. Enfoques basados en fragmentos en el descubrimiento de fármacos y biología química. Bioquímica 51, 4990–5003 (2012).

Artículo CAS Google Académico

Murray, CW, Verdonk, ML & Rees, DC Experiencias en el descubrimiento de fármacos basados en fragmentos. Tendencias Pharmacol Sci 33, 224–232 (2012).

Artículo CAS Google Académico

Congreve, M., Carr, R., Murray, C. y Jhoti, H. ¿Una 'regla de tres' para el descubrimiento de plomo basado en fragmentos? Drug Discov Today 8, 876–877 (2003).

Artículo Google Académico

Cheeseright, T., Mackey, M., Rose, S. & Vinter, A. Los extremos del campo molecular como descriptores de la actividad biológica: definición y validación. Revista de información química y modelado 46, 665–676 (2006).

Artículo CAS Google Académico

Kriwacki, RW, Hengst, L., Tennant, L., Reed, SI y Wright, PE Estudios estructurales de p21 (waf1/cip1/sdi1) en estado libre y unido a Cdk2: el trastorno conformacional media en la diversidad de unión. proc. nacional Academia ciencia EE. UU. 93, 11504–11509 (1996).

Artículo CAS ANUNCIOS Google Académico

Otieno, S. & Kriwacki, R. Sondeando el papel de la helicidad naciente en la función de p27 como regulador del ciclo celular. PLoS One 7, e47177 (2012). Pmc3470550.

Artículo CAS ANUNCIOS Google Académico

Follis, AV, Hammoudeh, DI, Wang, H., Prochownik, EV y Metallo, SJ Razón estructural para la unión y el despliegue acoplados de la oncoproteína c-Myc por moléculas pequeñas. Chem Biol 15, 1149–1155 (2008).

Artículo CAS Google Académico

Otieno, S., Grace, CR & Kriwacki, RW El papel del subdominio LH en la función de los reguladores de quinasa dependientes de ciclina Cip/Kip. Biophys J 100, 2486–2494 (2011). 3093569.

Artículo CAS Google Académico

Bowman, P., Galea, CA, Lacy, E. y Kriwacki, RW Caracterización termodinámica de las interacciones entre p27(Kip1) y Cdk2 activado y no activado: proteínas intrínsecamente no estructuradas como ataduras termodinámicas. Biochim Biophys Acta 1764, 182–189 (2006).

Artículo CAS Google Académico

Maybridge, TFSI Maybridge Ro3 Diversity Fragment Library, http://www.maybridge.com/Images/pdfs/MB_Ro3_fragment_flyer_2011_EUR_v7.pdf (2010).

Shelat, AA & Guy, RK Composición de andamios y relevancia biológica de las bibliotecas de detección. Nat Chem Biol 3, 442–446 (2007).

Artículo CAS Google Académico

Rishton, GM Compuestos reactivos y falsos positivos in vitro en HTS. Drug Discov Today 2, 382–384 (1997).

Artículo CAS Google Académico

Hann, M. et al. Agrupación estratégica de compuestos para detección de alto rendimiento. J Chem Inf Comput Sci 39, 897–902 (1999).

Artículo CAS Google Académico

Walters, WP & Murcko, MA Predicción de 'semejanza a las drogas'. Adv Drug Deliv Rev 54, 255–271 (2002).

Artículo CAS Google Académico

Allu, TK & Oprea, TI Evaluación rápida de la complejidad molecular y sintética para la química in silico. Revista de información química y modelado 45, 1237–1243 (2005).

Artículo CAS Google Académico

Keller, R. Tutorial de Asignación de Resonancia Asistida por Computadora (CANTINA Verlag, 2004).

Yuwen, T. & Skrynnikov, NR CP-HISQC: una mejor versión del experimento HSQC para proteínas intrínsecamente desordenadas en condiciones fisiológicas. J Biomol RMN 58, 175–192 (2014).

Artículo CAS Google Académico

Iwahara, J., Jung, YS & Clore, GM Espectroscopía de RMN heteronuclear para grupos de lisina NH(3) en proteínas: efecto único del intercambio de agua en la relajación transversal de (15)N. J Am Chem Soc 129, 2971–2980 (2007).

Artículo CAS Google Académico

Delaglio, F. et al. NMR Pipe: Un sistema de procesamiento espectral multidimensional basado en UNIX pipes. J. Biomol. RMN 6, 277–293 (1995).

Artículo CAS Google Académico

Salomon-Ferrer, R., Götz, AW, Poole, D., Le Grand, S. & Walker, RC Simulaciones rutinarias de dinámica molecular en microsegundos con AMBER en GPU. 2. Malla de partículas de solvente explícita Ewald. J. Chem. Cálculo de la teoría. 9, 3878–3888 (2013).

Artículo CAS Google Académico

Ramanathan, A. & Agarwal, PK Identificación computacional de fluctuaciones conformacionales lentas en proteínas. J Phys Chem B 113, 16669–16680 (2009). Pmc2872677.

Artículo CAS Google Académico

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Los autores agradecen a Christy R. Grace por su ayuda con los experimentos de RMN, a Heather Ross por la gestión de bibliotecas compuestas y a Ariele Viacava Follis por sus comentarios sobre el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud de EE. UU. (NIH) subvenciones R01CA082491 y 1R01GM083159 (a RWK), 2R01DC006471 y 1R21DC013879-01 (a JZ), Office of Naval Research Grants N000140911014, N000141210191 y N00014121 0775 (a JZ), ciudadano estadounidense Cancer Institute Cancer Center Support Grant P30CA21765 (en St. Jude Children's Research Hospital) y ALSAC. LII recibió la Beca de la Fundación Garwood del St. Jude Children's Research Hospital. DB quisiera agradecer el apoyo del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de EE. UU. (F32GM113290).

Kavitha Bharatam

Dirección actual: Centro de Biología Química y Terapéutica, Instituto de Biología de Células Madre y Medicina Regenerativa, GKVK, Bellary Road, Bangalore, 560065, India

Departamento de Biología Estructural, Memphis, TN, 38105

Luigi I. Iconaru, David Ban, Weixing Zhang y Richard W. Kriwacki

Departamento de Neurobiología del Desarrollo, Memphis, TN, 38105

Luigi I. Iconaru y Jian Zuo

Departamento de Biología Química y Terapéutica, St. Jude Children's Research Hospital, Memphis, TN, 38105

Kavitha Bharatham y Anang A. Shelat

División de Ingeniería y Ciencias Computacionales, Instituto de Ciencias de Datos de Salud, Laboratorio Nacional de Oak Ridge, Oak Ridge, TN, 37830

Arvind Ramanathan

Departamento de Microbiología, Inmunología y Bioquímica, Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Tennessee, Memphis, TN, 38163

Richard W. Kriwacki

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investigación diseñada por LII, DB, AR, WZ, AS, JZ y RWK; LII, DB, KB y AR realizaron experimentos; datos analizados LII, DB, KB, AR, AS y RWK; y LII, DB, AR, AS, JZ y RWK escribieron el manuscrito.

Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

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Reimpresiones y permisos

Iconaru, L., Ban, D., Bharatham, K. et al. Descubrimiento de moléculas pequeñas que inhiben la proteína desordenada, p27Kip1. Informe científico 5, 15686 (2015). https://doi.org/10.1038/srep15686

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Recibido: 14 julio 2015

Aceptado: 25 de septiembre de 2015

Publicado: 28 de octubre de 2015

DOI: https://doi.org/10.1038/srep15686

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